Scuola Normale Superiore
Brevetto N. EP3371596B1 Titolare: Scuola Normale Superiore
Inventori: Antonino Cattaneo, Michele Chirichella
DESCRIZIONE DELLA TECNOLOGIA
L’isolamento di Anticorpi diretti contro le proteine PTM native (native post-translationally modified proteins), tecnologia sviluppata presso la Scuola Normale, e denominata Post translational Intracellular Silencing Antibodies (PISA), consente di selezionare a livello intracellulare domini anticorpali contro le proteine PTM. Per fare ciò è stata combinata la IACT (Intracellular Antibody Capture Technology) con la Tethered Catalysis. La prima è una piattaforma di selezione Yeast 2-Hybrid (Y2H) che consente l’isolamento di intrabodies sensibili alla conformazione, direttamente nell’ambiente intracellulare, da una libreria di domini anticorpali, senza necessità di manipolazione delle proteine. Per questi motivi, i PISA sono intrinsecamente convalidati per funzionare a livello intracellulare, eliminando la necessità di provare in blind diversi cloni di anticorpi selezionati con tecniche in vitro (ad es. Phage display). Nel metodo PISA, un’esca Y2H è geneticamente fusa con il dominio catalitico di un enzima modificante per essere costitutivamente PT-modificata in cis e quindi testata contro una libreria non immune di domini di anticorpi murini (SPLINT, Single Pot Library of INTracellular antibodies). Test sperimentali del proof-of-concept del metodo (Chirichella et al. 2017) hanno permesso di isolare due diversi intrabodies, capaci di legare specificamente e selettivamente le forme acetilate di HIV-1 integrasi e dell’istone H3, rispettivamente. Tali anticorpi sono stati caratterizzati e convalidati in saggi intracellulari, dimostrando interazioni selettive con le PTM, con conseguente interferenza cellulare selettiva per il target PTM. Si è poi dimostrato che l’interferenza selettiva contro la proteina PTM è effettivamente molto più specifica, nei suoi effetti, rispetto all’interferenza farmacologica contro l’enzima che introduce la PTM, fornendo così la dimostrazione sperimentale comparativa della superiorità della tecnologia PISA. Questa dimostrazione di principio mostra la fattibilità, non ovvia né banale, di una piattaforma generale per la selezione di anticorpi che riconoscano una diversità di proteine modificate con PTM.
Gli anticorpi selezionati con metodi alternativi, quali phage-display, non hanno i vantaggi degli anticorpi isolati dalla tecnologia PISA, primo su tutti il fatto che gli anticorpi selezionati con PISA funzionano intracellularmente (Intrabodies) e possono quindi essere utilizzati direttamente per la validazione del target PTM. In secondo luogo, gli anticorpi PISA riconoscono epitopi modificati post-traduzionalmente nella loro conformazione nativa, in quanto riconoscono la proteina prodotta dalla cellula nella sua conformazione fisiologica. Inoltre questo tipo di selezione
permette la risoluzione di un collo di bottiglia ben noto nel settore della produzione di anticorpi, che consiste nella produzione e purificazione sia della proteina target che poi dell’anticorpo. Con PISA, sia l’espressione della proteina-esca che della preda avviene direttamente dalle sequenze geniche espresse nella cellula, senza alcun bisogno di sintetizzare o purificare la proteina modificata post traduzionalmente o l’anticorpo che deve riconoscerla: from genes to antibodies, o addirittura, from genes to antibody genes. Questi vantaggi permettono di facilitare grandemente l’isolamento di questa classe di anticorpi fondamentali per lo studio del proteoma. Gli anticorpi isolati con la tecnologia PISA permetteranno di sviluppare nuovi diagnostici, nuovi saggi cellulari per screening di farmaci ed anche potranno costituire la base per lo sviluppo di una nuova generazione di farmaci. La tecnologia finora sviluppata permetterà di ottenere, con maggiore plasticità, velocità di esecuzione, facilità di ottenimento e robustezza, anticorpi che possono essere utilizzati per usi di ricerca, diagnostica, target validation, cellular bioassays per screening, fino ad arrivare a leads di interesse terapeutico e anticorpi specifici che, una volta generati, potranno essere ulteriormente proteggibili (IP Asset) e utilizzabili distintamente come strumenti per l’identificazione di specifiche patologie (asset commerciale).
OBIETTIVI DEL POC E RISULTATI ATTESI
L’obiettivo primario del progetto sarà l’identificazione, la validazione e il Business development di una killer application su cui si concentreranno gli sforzi sperimentali e commerciali. Saranno identificate partnerships per lo sviluppo tecnologico e industriale, valutando ulteriori integrazioni e ampliamenti della protezione brevettuale, pianificando le attività’ di business planning per uno spin off di successo. Il principale obiettivo industriale e del progetto è l’identificazione, lo sviluppo e la validazione di intrabodies anti Post Translational Modified Protein per identificare, diagnosticare e/o trattare una o più specifiche patologie. Tali intrabodies potranno essere identificati tra quelli precedentemente selezionati (i) oppure diretti verso nuovi target (ii).
(i) Un’opportunità che la tecnologia potrà esplorare, viste le evidenze presenti in letteratura, è costituita dalla produzione di Intrabodies contro la proteina Tau fosforilata. Le proteine Tau iperfosforilate sono caratteristiche dei disturbi neurodegenerativi denominati collettivamente tauopatie. Ci sono 85 potenziali siti di fosforilazione sull’isoforma Tau più lunga presente nel cervello, e circa 71 di questi possono essere fosforilati in condizioni fisiologiche o patologiche (Alonso, A.D. 2010; Iqbal, K. 2013; Jin, N. 2015; Liu, F. 2006; Wang, X. 2015; Wang, X.2010). La maggior parte dei siti di fosforilazione si trova a livello dei siti di legame ai microtubuli, così le proteine Tau fosforilate diventano incapaci di legare la tubulina nei microtubuli, e tendono a formare aggregati. Ad oggi, il targeting delle tau chinasi rappresenta il principale approccio terapeutico. Piccole molecole che inibiscono le chinasi coinvolte nella fosforilazione di Tau come CDK5 e GSK3β esercitano effetti neuroprotettivi nei modelli murini ma hanno effetti pleiotropici non correlati alla Tau, poiché questi enzimi fosforilano centinaia di altre proteine. La possibilità di selezionare anticorpi anti fosfo-Tau con PISA permetterebbe il loro impiego come intrabodies da usare sia come strumenti per la validazione di quali siti di fosforilazione siano un buon target da colpire, che, successivamente come farmaci leads per prevenire l’aggregazione della proteina Tau. Un nuovo possibile target è rappresentato dalla proteina PTM Acetyl (Lys 310) RelA, che è necessaria per regolare l’attività trascrizionale di NF-kB, ed è coinvolta nell’effetto tossico provocato dall’attivazione di NF-kB nel danno ischemico acuto (A. Lanzillotta et al., Cell death and Dis 2010) nonché nella proliferazione e tumorigenicità delle cellule tumorali (Zou Z et al. Oncogene 2014). Un intrabody contro Acetyl (Lys310) Rel A potrebbe bloccare l’interazione tra Brd4 e Acetylated RelA, che è essenziale per l’attivazione trascrizionale di NF-kB. Precedenti studi che utilizzano un inibitore farmacologico di Brd4 (JQ1, una piccola molecola in grado di interrompere l’interazione tra Acetyl-RelA e Brd4) hanno dimostrato l’inibizione della proliferazione e del potenziale di trasformazione della linea cellulare di tumore polmonare A549. Inoltre, in un modello di xenotrapianto di A549 nei topi, la crescita dei tumori è stata notevolmente ridotta nei topi trattati con JQ1. Pertanto, mirare specificamente all’acetil (Lys310) RelA con un intrabody potrebbe rappresentare un nuovo e semplice approccio terapeutico per il trattamento del tumore. La disponibilità di una small molecule (JQ1) che inibisce l’interazione tra Brd4 e Acetylated RelA fornisce un utilissimo benchmark che funzionerà da “controllo positivo” e da benchmark per la nostra tecnologia.
Un ulteriore obiettivo di lungo termine, è sviluppare la tecnologia PISA in una piattaforma per la target validation di target terapeutici. Ad oggi infatti non è ancora possibile selezionare e validare target anti-PTM, quindi nemmeno derivarne dei farmaci. La tecnologia verrà quindi utilizzata anche come piattaforma innovativa per la validazione di target di interesse terapeutico, attraverso lo sviluppo di saggi cellulari funzionali e rilevanti per la patologia di interesse.
La suddetta tecnologia, e il brevetto/i connesso/i, una volta ulteriormente sviluppati e avanzati nel livello di TRL, saranno oggetto di sfruttamento commerciale, tramite licensing ad una azienda potenzialmente interessata o ad una spin off che possa occuparsi di un ulteriore incremento tecnologico, veicolando i risultati verso ulteriori obiettivi di sviluppo industriale e commerciale.
DURATA DEL PROGETTO: 18 mesi
PER INFORMAZIONI: kto@sns.it
SCHEDA KNOWLEDGE SHARE (https://www.knowledge-share.eu/brevetto/pisa-librerie-di-anticorpi-ricombinanti-diretti-contro-modificazioni-post-traduzionali/)
CONTATTO:
ANTONINO.CATTANEO@SNS.IT; GABRIELE.UGOLINI@SNS.IT